La vaccinazione SARS-CoV-2 può provocare un’epatite dominante a cellule T CD8

Journal of Hepatology

Mette in risalto

  • Identificazione di immunocorrelati in un caso di epatite autoimmune associata al vaccino mRNA
  • La citometria di massa per immagini identifica l’arricchimento panlobulare intraepatico delle cellule T CD8 citotossiche attivate
  • La citometria a flusso identifica l’arricchimento intraepatico delle cellule T CD8 attivate con specificità SARS-CoV-2
  • L’attivazione delle cellule T CD8 specifiche per SARS-CoV-2 periferica è correlata ai livelli di ALT

Astratto

Sfondo e obiettivi

Episodi di epatite autoimmune sono stati descritti in seguito all’infezione e alla vaccinazione da SARS-CoV-2, ma la loro fisiopatologia rimane poco chiara. Qui, riportiamo il caso di un maschio di 52 anni, che presenta episodi bimodali di epatite acuta, ciascuno dei quali si verifica 2-3 settimane dopo la vaccinazione con mRNA BNT162b2 e abbiamo cercato di identificare i correlati immunitari sottostanti. Il paziente ha ricevuto la prima budesonide orale, ha avuto una ricaduta, ma ha ottenuto la remissione sotto steroidi sistemici.

Metodi

La citometria di massa di imaging per la profilazione immunitaria spaziale è stata eseguita sul tessuto della biopsia epatica. La citometria a flusso è stata eseguita per sezionare i fenotipi delle cellule T CD8 e identificare le cellule T specifiche per SARS-CoV-2 e specifiche per EBV longitudinalmente. Gli anticorpi indotti dal vaccino sono stati determinati mediante ELISA. I dati sono stati correlati con i laboratori clinici.

Risultati

L’analisi del tessuto epatico ha rivelato un infiltrato immunitario dominato quantitativamente da cellule T CD8 citotossiche attivate con distribuzione panlobulare. È stato anche osservato un arricchimento di cellule T CD4, cellule B, plasmacellule e cellule mieloidi rispetto ai controlli. L’infiltrato intraepatico ha mostrato un arricchimento per le cellule T CD8 con specificità SARS-CoV-2 rispetto al sangue periferico. In particolare, la gravità dell’epatite era correlata longitudinalmente con un fenotipo citotossico attivato di cellule T CD8+ specifiche per SARS-CoV-2, ma non specifiche per EBV o immunoglobuline indotte dal vaccino.

Conclusioni

La vaccinazione COVID19 può suscitare una distinta epatite immuno-mediata dominante a cellule T con un patomeccanismo unico associato all’immunità residente tissutale antigene-specifica indotta dalla vaccinazione che richiede immunosoppressione sistemica.

Riepilogo laico

L’infiammazione del fegato si osserva durante l’infezione da SARS-CoV-2, ma può verificarsi anche in alcuni individui dopo la vaccinazione e condivide alcune caratteristiche tipiche della malattia epatica autoimmune. In questo rapporto, mostriamo che le cellule T altamente attivate si accumulano e sono distribuite uniformemente nelle diverse aree del fegato in un paziente con infiammazione del fegato dopo la vaccinazione SARS-CoV-2. Inoltre, all’interno di queste cellule T che si infiltrano nel fegato, abbiamo osservato un arricchimento delle cellule T che sono reattive alla SARS-CoV-2, suggerendo che queste cellule indotte dal vaccino possono contribuire all’infiammazione del fegato in questo contesto.
Graphic Abstract

Introduzione

La vaccinazione è la strategia chiave per combattere la pandemia globale di COVID19. Non c’era alcun segnale di sicurezza per l’epatite negli studi di vaccinazione COVID19 . Tuttavia diversi rapporti hanno recentemente associato condizioni simili all’epatite autoimmune (AIH) con i vaccini COVID19 [ ].

A nostra conoscenza, non è stato segnalato alcun caso grave di insufficienza epatica che richieda il trapianto di fegato. Il danno epatico è stato osservato dopo entrambi i vaccini a base di mRNA e vettori, mentre il tempo dalla somministrazione del vaccino all’insorgenza dei sintomi variava da 4 giorni dopo la prima dose a 6 settimane dopo la seconda dose. Un paziente è stato riesposto al vaccino che ha portato a un peggioramento del danno epatico 

Non è chiaro se l’associazione segnalata dell’epatite autoimmune con la vaccinazione sia casuale, potrebbe riflettere un danno epatico transitorio indotto da farmaci o potrebbe implicare un’attivazione immunitaria specifica dell’antigene indotta da SARS-CoV-2. 

Tuttavia, il fatto che condizioni simili all’AIH si siano verificate anche dopo l’infezione da SARS-CoV-2 suggerisce che quest’ultimo potrebbe essere un fattore trainante per i casi sporadici.

Qui, descriviamo il caso di un maschio di 52 anni che presenta epatite acuta mista epatocellulare/colestatica dopo la prima dose di vaccino mRNA BNT162b2 e grave epatite dopo la seconda dose. La valutazione diagnostica era compatibile con i criteri per l’epatite autoimmune (AIH). Dopo l’inizio della terapia orale con budesonide, i test di funzionalità epatica sono migliorati per un mese prima che si verificasse una ricaduta che è stata trattata con successo con prednisolone sistemico e acido ursodesossicolico. Una valutazione immunologica completa degli infiltrati infiammatori nel fegato ha rivelato la presenza di un infiltrato di cellule T CD8 citotossiche altamente attivato, inclusa una popolazione di cellule T CD8 specifiche per SARS-CoV-2 correlata con l’attivazione periferica di CD8 specifiche per SARS-CoV-2 cellule T,

Decorso clinico

Il paziente di sesso maschile di 52 anni senza una storia medica degna di nota a parte l’ipotiroidismo preesistente in terapia sostitutiva a lungo termine con levotiroxina e test di funzionalità epatica normale (LFT) ha sviluppato nausea progressiva, affaticamento, perdita di appetito e prurito con sintomi che iniziano circa 10 giorni dopo la prima dose (prime) del vaccino mRNA BNT162b2. Successivamente ha sviluppato ittero e si è presentato al suo medico di base con LFT indicativo di epatite acuta mista epatocellulare/colestatica (ALT: 2130 U/l, AP: 142 U/l gamma-GT: 217 U/l, Bilirubina 7,7 mg/dl) ( Fig. 1). Il paziente è stato ricoverato in un centro di cure primarie 25 giorni dopo la prima vaccinazione. L’epatite virale A, B, C ed E così come le infezioni da citomegalovirus e virus di Epstein-Barr sono state escluse dalla sierologia e/o dal test PCR. La genotipizzazione HFE non ha rivelato variazioni associate all’emocromatosi. Inoltre, non è stato riscontrato alcun consumo significativo di alcol e la sierologia autoimmune è rimasta inconcludente con la reattività borderline AMA-M2. Il paziente si è ripreso rapidamente senza una terapia specifica ed è stato dimesso con LFT in diminuzione dopo tre giorni sotto la diagnosi differenziale principale di un’epatite tossica. Nelle due settimane successive, gli enzimi epatici sono ulteriormente diminuiti, con la normalizzazione di AST e AP e il paziente ha ricevuto la sua seconda dose (boost) del vaccino mRNA BNT162b2 41 giorni dopo la prima vaccinazione ( Fig. 1). 20 giorni dopo la vaccinazione boost (dpb), il paziente ha rivissuto nausea e affaticamento. I test di laboratorio hanno rivelato una ricaduta di epatite mista acuta con (ALT 1939 U/l, ALP 167 U/l, bilirubina 2,9 mg/dl). Successivamente è stato indirizzato al nostro centro terziario a 26 dpb. La sierologia autoimmune è stata ripetuta con lieve iperglobulinemia (livelli di IgG 1,02 volte rispetto all’ULN, livelli normali di IgA e IgM), ANA (1:200) e positività borderline per anticorpi anti-muscolo liscio e AMA-M2 mentre i test per anti-LKM sono rimasti negativi . Abbiamo eseguito una biopsia epatica che istologicamente ha mostrato epatite di interfaccia con un grado moderato di infiltrato linfoplasmocitico e focolai di necrosi lobulare e apoptosi. Non erano presenti granulociti eosinofili. Non sono state osservate fibrosi perisinusoidale né portale rilevanti. Insieme e il paziente è stato trattato con 9 mg di budesonide orale al giorno. Nelle settimane successive gli enzimi epatici sono diminuiti prima che si verificasse una ricaduta 39 giorni dopo l’inizio della terapia (66 dpb), che è stata controllata successivamente dopo l’escalation della terapia con steroidi sistemici in combinazione con acido ursodesossicolico. Gli LFT del paziente si sono successivamente normalizzati entro 8 settimane ( Fig. 1 ). Gli anticorpi anti-spike non hanno mostrato fluttuazioni maggiori con titoli simili rispetto agli individui sani al momento della diagnosi a 27 giorni dopo la vaccinazione boost ( Fig. 1 B) e una riduzione prevista dei titoli nel tempo ( Fig 1 C).

Risultati

Analisi immunitaria spaziale profonda del tessuto epatico

Per comprendere più in dettaglio l’infiltrato immunitario nel fegato, oltre all’istochimica convenzionale, abbiamo eseguito una citometria di massa di imaging altamente multiplex con un ampio pannello che copre popolazioni immunitarie rilevanti. Come mostrato nella figura 2 A, questo ha rivelato infiltrati costituiti da cellule T, macrofagi, cellule B, plasmacellule e granulociti nel fegato. Il numero assoluto di cellule immunitarie era 5,3 volte maggiore rispetto al tessuto epatico di controllo non malato ottenuto da resezioni epatiche ( Fig. 2 B). È interessante notare che tra l’infiltrato immunitario, i linfociti T CD8 rappresentavano il sottogruppo di cellule immunitarie più abbondante (465 per mm 2), cosa inaspettata per AIH. Al contrario, i linfociti B e le plasmacellule che sono tipicamente arricchiti in AIH, sono stati trovati in numeri relativamente bassi (rispettivamente 102 per mm 2 e 66 per mm 2 ), anche se queste popolazioni erano anche arricchite nell’infiltrato immunitario rispetto ai controlli ( Fig . 2 E). Questi risultati hanno suggerito un diverso contributo delle cellule immunitarie rispetto alla tipica AIH spontanea. Successivamente abbiamo valutato la localizzazione spaziale dei diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie all’interno del parenchima epatico. L’infiltrazione immunitaria più forte è stata osservata nelle aree periportali ( Fig. 2 C). In particolare, mentre anche i linfociti B e le plasmacellule erano arricchiti ma prevalentemente presenti nelle aree periportali, la distribuzione dei linfociti T CD8 era panlobulare ( Fig. 2CD). Per testare i correlati immunitari del danno epatico, abbiamo valutato il marcatore granulare citotossico Granzyme B. È interessante notare che abbiamo osservato un forte accumulo di cellule T CD8 citotossiche (Granzyme B-positive) mentre altri sottoinsiemi di cellule immunitarie che esprimono Granzyme B, come i granulociti, non sono stati aumentati ( Fig. 2 E). Questi dati sono anche in linea con la nostra osservazione dell’aumentata espressione intraepatica di CD38, HLA-DR e fattore di trascrizione T-bet come marcatori di cellule T effettrici attivate ( Fig. 2 A, F). Sulla base del loro forte arricchimento, distribuzione ampiamente diffusa e fenotipo citotossico attivato all’interno del parenchima epatico, abbiamo ipotizzato che i linfociti T CD8 potrebbero essere i driver dell’infiammazione epatica.

Immunofenotipizzazione periferica intraepatica e longitudinale delle risposte delle cellule T CD8 associate alla vaccinazione

Successivamente abbiamo eseguito un’analisi dettagliata delle popolazioni di cellule T CD8 intraepatiche e periferiche utilizzando la citometria a flusso. La popolazione di cellule T CD8 intraepatiche del paziente è stata arricchita per i marcatori di residenza tissutale (CXCR6, CD69 e CD103) e di attivazione (CD38) ( Fig. 3 A). L’espressione di CD38 sui linfociti T CD8 è stata osservata anche nel sangue periferico. È interessante notare che i livelli di espressione di CD38 erano marcatamente elevati nel paziente rispetto ai vaccinati di controllo corrispondenti al punto temporale post-vaccinazione che non hanno sviluppato epatite (75,9% vs 15,4%, rispettivamente) ( Fig. 3B). L’insolita espansione delle cellule T citotossiche attivate osservata nella nostra analisi spaziale ci ha portato a ipotizzare che i linfociti T CD8 specifici della punta SARS-CoV-2 indotti dalla vaccinazione potrebbero contribuire alla malattia del fegato poiché abbiamo recentemente osservato una rapida induzione di SARS-CoV-2 cellule T CD8 specifiche per spike dal vaccino mRNA BNT162b2[]. Infatti, utilizzando un tetramero HLA-A*03 abbinato al paziente caricato con un epitopo di punta SARS-CoV-2 (S 378-386 ) abbiamo identificato le cellule T CD8 specifiche per la punta. Nel sangue periferico, le cellule T CD8 specifiche per la punta erano 10,2 volte più abbondanti delle cellule T specifiche per un epitopo di controllo delle cellule T CD8+ specifico per EBV ( Suppl. Fig. 1 ). Abbiamo anche identificato le cellule T CD8 specifiche per la punta nel fegato. Rispetto al sangue periferico, il pool di cellule T CD8 intraepatico era ∼ 3,4 volte arricchito per le cellule T CD8 specifiche per spike ( Fig. 3 C) e mostrava caratteristiche residenti nei tessuti (CXCR6, CD103, CD69) e una forte attivazione come indicato da CD38 espressione ( Fig. 3C). La proteina Spike non è stata identificata nel fegato al momento dell’analisi mediante immunoistochimica (dati non mostrati). Successivamente abbiamo chiesto se la frequenza e il fenotipo attivato dei linfociti T CD8 specifici per il picco circolanti fossero mantenuti durante la terapia. È interessante notare che le analisi longitudinali hanno mostrato frequenze stabili di cellule T CD8 specifiche per spike circolanti ( Fig. 3 D) con livelli di espressione di CD38 decrescenti dopo l’inizio della terapia con budesonide e in coincidenza con il calo dei livelli di transaminasi. Tuttavia, l’espressione di CD38 su cellule T CD8 specifiche per spike e altri marcatori associati alla citotossicità come GzmB e T-bet è aumentata quando il paziente ha avuto una ricaduta in terapia con budesonide, quindi si è normalizzata dopo l’introduzione della terapia immunosoppressiva sistemica ( Fig. 3PER ESEMPIO). Questo modello non è stato osservato per le cellule T CD8 specifiche per EBV con LMP-1 419-427 caricate con HLA-A*24:02 ( Supp Fig 1 ). Inoltre, non è stato osservato per le analisi di massa di cellule T CD8, che tuttavia hanno mostrato un’elevata abbondanza di popolazioni di cellule T CD8 citototossiche attivate nella periferia ( Fig. 3 E-G). In sintesi, questi dati indicano un’ampia attivazione di cellule T CD8 citotossiche con il fenotipo periferico di cellule T CD8+ specifiche per spike che riflette il pattern di risposta clinica alla terapia immunosoppressiva.

Discussione

La malattia autoimmune simile all’epatite dopo la vaccinazione contro SARS-CoV-2 è ora riconosciuta come un raro evento avverso non identificato nei primi studi. L’uso diffuso del vaccino con la somministrazione di centinaia di milioni di dosi in tutto il mondo solleva anche questioni di causalità vs. coincidenza. In particolare, la malattia simile all’AIH dopo la vaccinazione è stata segnalata in pazienti con caratteristiche di età e sesso tipiche dell’AIH spontanea 
 
Sebbene alcuni di questi casi possano quindi rappresentare una coincidenza, è anche possibile una relazione causale con il vaccino, come l’epatite da astante causata dall’aumento delle citochine o chemochine sistemiche dopo la vaccinazione, simile ai casi che si verificano in associazione con l’infezione naturale da SARS-CoV-2 
. I diversi modelli di manifestazione clinica e l’ampio intervallo di tempo trascorso tra la somministrazione del vaccino e l’insorgenza dei sintomi suggeriscono chiaramente che meccanismi diversi possono contribuire a questi casi segnalati. Qui, la nostra analisi evidenzia che le cellule T CD8 citotossiche attivate, comprese le cellule T CD8 specifiche per spike indotte dal vaccino, potrebbero contribuire alla patogenesi della malattia.
È importante sottolineare che l’epatite autoimmune è una condizione che richiede una terapia immunosoppressiva per tutta la vita in molti pazienti affetti.
È quindi importante differenziare l’AIH dall’epatite immuno-mediata possibilmente transitoria dopo la vaccinazione. La diagnosi di epatite autoimmune viene in genere stabilita utilizzando strumenti di punteggio AIH basati su test di funzionalità epatica, sierologia autoanticorpale e caratteristiche istologiche tipiche come l’epatite dell’interfaccia e l’arricchimento delle plasmacellule [.  Nel nostro caso, prima della terapia, la diagnosi di AIH era considerata “probabile” sulla base del punteggio AIH originale modificato. È importante notare in questo contesto che il primo episodio di epatite acuta dopo la prima dose di vaccino è stato autolimitante senza terapia, il che ha anche guidato la nostra scelta di iniziare la terapia con budesonide nel tentativo di ridurre al minimo gli effetti collaterali sistemici e di mantenere anti- -Immunità SARS-Cov2 se possibile. Tuttavia, il nostro paziente ha avuto una ricaduta 3-4 settimane dopo la terapia con budesonide e quindi ha richiesto una terapia steroidea sistemica, che è stata empiricamente combinata con acido ursodesossicolico, una combinazione utilizzata nella terapia della sindrome da sovrapposizione di epatite autoimmune che è stata scelta per la presenza di AMA-M2 anticorpi che si trovano tipicamente nella colangite biliare primitiva  Il paziente si è successivamente ripreso rapidamente, con solo una gengivite che si è verificata durante la terapia steroidea sistemica come possibile evento correlato all’immunosoppressione. A causa della recidiva dell’epatite dopo la riduzione graduale degli steroidi, il paziente è stato sottoposto a terapia immunosoppressiva di mantenimento a lungo termine in base alla quale ha ottenuto una completa remissione biochimica.
Meccanicamente, la manifestazione della malattia nel nostro paziente era distinta dalla classica AIH spontanea, che è tipicamente associata a immunoglobuline periferiche elevate, un infiltrato dominato da plasmacellule e un’epatite dell’interfaccia prominente. Qui, mentre c’era un leggero aumento delle immunoglobuline periferiche e dell’arricchimento intraepatico delle cellule B intraepatiche e delle plasmacellule, è stata osservata una correlazione più sorprendente a livello delle cellule T CD8 citotossiche. Le cellule T CD8 citotossiche attivate sono state fortemente arricchite nel fegato del paziente in misura tale da rappresentare la popolazione di cellule immunitarie intraepatiche più abbondante e includevano risposte specifiche SARS-CoV2 provocate dal vaccino. In particolare, lo stato di attivazione periferica di queste cellule T CD8 specifiche per spike era correlato alla gravità dell’epatite e al decorso clinico dopo l’introduzione della terapia immunosoppressiva. Questi risultati implicano le cellule T come un tipo di cellula immunitaria patogeno chiave di questa epatite immunitaria associata al vaccino come un nuovo sottotipo di epatite autoimmune. Il precoce aumento dei valori di ALT dopo la prima e la seconda dose di BNT162b2 e l’osservazione che i linfociti T CD8, inclusi i linfociti T CD8+ specifici per lo spike, dominano l’infiltrato immunitario, si adatta anche a recenti osservazioni che dimostrano una mobilizzazione precoce dei linfociti T CD8 specifici per lo spike già dopo la prima dose del vaccino . Da notare che il nostro reagente tetramero probabilmente colora solo una frazione delle cellule T antigene-specifiche indotte dalla vaccinazione, adattandosi all’ampia espressione dell’attivazione delle cellule T e dei marcatori di citotossicità osservata nell’analisi della popolazione di cellule T CD8 di massa. Tuttavia, è anche possibile che l’ampio pattern di attivazione osservato coinvolga altre popolazioni di cellule T CD8 “astanti” non SARS-CoV2 specifiche. Inoltre, il meccanismo preciso che provoca l’infiltrazione delle cellule T CD8 specifiche per la punta nel fegato che adottano le caratteristiche delle cellule T di memoria residenti nei tessuti (TRM) rimane poco chiaro. Le cellule T CD8+ virus-specifiche possono accumularsi nel fegato anche se il sito primario dell’infezione è distante, come durante l’infezione da influenza ed è possibile che il fegato possa fungere da “cimitero” per le cellule T attivate
Tuttavia, i linfociti T CD8 citotossici attivati ​​possono mediare l’epatite anche in assenza di antigene. . Inoltre, nelle infezioni acute è stata descritta una citotossicità innata, indipendente dal TCR, dei linfociti T secondari. . Da notare, le cellule CXCR6+ CD8+ TRM, come quelle trovate in questo paziente, possono mediare l’autoaggressione nelle malattie metaboliche del fegato, in risposta a segnali infiammatori locali . Mentre questi rapporti sollevano la possibilità di un’epatite mediata da cellule T antigene-indipendente, un’altra possibile spiegazione potrebbe essere la presenza del loro antigene affine, cioè la proteina spike. Sebbene non siamo stati in grado di rilevare la proteina spike da parte dell’IHC nel fegato, va notato che la biopsia è stata eseguita 27 giorni dopo la seconda dose di vaccino e l’espressione transitoria dopo la vaccinazione, il che potrebbe aver causato cellule T CD8 specifiche per spike che esprimono CXCR6 a casa al fegato e alle cellule presentanti l’antigene bersaglio, non possono essere escluse. Tuttavia, meccanismi aggiuntivi, come il riconoscimento incrociato dell’antigene, possono anche contribuire all’immunopatologia. In sintesi, il vaccino BNTb163b2 può innescare l’epatite immuno-mediata da meccanismi legati all’immunità cellulare indotta dal vaccino. Questo caso illustra l’induzione di un’insolita epatite autoimmune dominante a cellule T CD8 dopo la vaccinazione con mRNA BNT162b2, con arricchimento di cellule T CD8 specifiche per SARS-Cov2 indotte dal vaccino. Nei pazienti con epatite che si manifesta dopo la prima dose di vaccino, dosi aggiuntive possono innescare una significativa autoimmunità epatica e richiedere una soppressione immunitaria a lungo termine.

Metodi

Campioni di pazienti

Un uomo di 52 anni e 3 operatori sanitari (tutti HLA-A*03:01, confermati da NGS) >26 giorni dopo la vaccinazione boost che hanno ricevuto il vaccino mRNA BNT162b2 sono stati reclutati presso il Centro medico universitario di Friburgo, in Germania. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti. Inoltre, dall’Istituto di patologia chirurgica di Friburgo sono stati prelevati 5 campioni di tessuto epatico sano (tessuto distante da metastasi epatiche del cancro del colon-retto). Lo studio è stato condotto secondo le linee guida federali e le normative del comitato etico locale (Albert-Ludwigs-University Freiburg, Germania; voto: #21-1135 e #21-1372) e la Dichiarazione di Helsinki (1975).

Citometria di massa per immagini

Il tessuto epatico è stato ottenuto mediante biopsia transcutanea, fissato in formalina, incluso in paraffina, tagliato in sezioni da 4 μm e colorato come descritto in precedenza.
In breve, dopo la deparaffinazione, la reidratazione, il recupero dell’antigene e il blocco, i vetrini sono stati colorati con anticorpi marcati con metallo ed essiccati all’aria. L’acquisizione dell’immagine della biopsia (30,912 mm 2 ) e 2,25 mm 2 dei campioni di controllo è stata eseguita utilizzando un sistema di imaging Hyperion (Fluidigm; USA). Le ROI sono state asportate al laser punto per punto a 200 Hz, ottenendo una risoluzione in pixel di 1 μm 2. La visualizzazione delle immagini è stata eseguita con FIJI (v1.52p, ImageJ). La segmentazione delle singole celle è stata condotta utilizzando una pipeline di analisi supervisionata e imparziale adattata utilizzando Ilastik (v 1.3.3) e CellProfiler (v 3.1.9). Per analizzare le zone del fegato, la distanza di ciascun pixel da GLUL, CD34 e α-SMA è stata calcolata utilizzando CellProfiler (v 4.0.4), aggiunto alle informazioni ad alta dimensione di ciascuna cellula e utilizzato per il gating in OMIQ (Omiq Inc). Le zone epatiche sono state definite: centrolobulare (distanza da GLUL ≤50 μm), periportale (distanza da GLUL >50 μm e distanza da CD34 e α-SMA ≤50 μm) e intermedie (distanza da GLUL >50 μm e distanza da CD34 e α- SMA >50 μm). La conta cellulare assoluta è stata normalizzata a 1 mm 2 . I grafici a barre in pila sono stati creati con la versione R 4.0.1 utilizzando ggplot2.

Isolamento PBMC

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da campioni di sangue anticoagulato dopo centrifugazione in gradiente di densità e successivamente conservate a -80°C fino a ulteriore utilizzo.

Sospensione unicellulare da biopsia epatica

Il tessuto epatico rimanente è stato omogeneizzato meccanicamente e filtrato attraverso un colino cellulare da 70 μm (Corning). Le cellule sono state lavate e processate direttamente per l’analisi della citometria a flusso. Inoltre, anche i PBMC appena isolati sono stati colorati e analizzati mediante citometria a flusso.

Analisi di cellule T CD8+ specifiche per spike

Il peptide della punta SARS-CoV-2 (S 378-386 : KCYGVSPTK) è stato sintetizzato con una purezza >70% (Genaxxon Bioscience, caricato su HLA-A*03:01 easYmers® (immunAware) e successivamente coniugato con phyocerythrin (PE) -streptavidina (Agilent) secondo le istruzioni del produttore.Le cellule T CD8+ specifiche per Spike(A*03/S 378 ) sono state analizzate dopo l’arricchimento a base di microsfere magnetiche come descritto in precedenza.10 In breve, le PBMC sono state incubate con S 378 tetramerizzato coniugato con PE 386 -loaded HLA-A*03:01 easYmers Allo stesso modo, i linfociti T CD8+ specifici per EBV sono stati rilevati utilizzando LMP-1 tetramerizzato coniugato con PE 419-427-caricato HLA-A*24:02 easYmers. Le cellule T CD8+ virus-specifiche sono state arricchite dalla tecnologia MACS utilizzando perline anti-PE. Successivamente, sia i campioni arricchiti che quelli pre-arricchiti sono stati analizzati mediante citometria a flusso multiparametrica. Le frequenze delle cellule T CD8+ specifiche per la punta sono state calcolate come descritto prima del 10,11 . I campioni arricchiti con meno di 5 cellule T CD8+ virus-specifiche sono stati esclusi dall’analisi finale, risultando in un limite di rilevamento di 5*10 -6 cellule T CD8+ virus-specifiche.

Citometria a flusso multiparametrica

Gli anticorpi sono stati utilizzati per l’analisi della citometria a flusso. FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher) e Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences) sono stati utilizzati rispettivamente per le molecole intranucleari e citoplasmatiche. Dopo la fissazione delle cellule in paraformaldeide al 2%/PBS (Sigma), l’acquisizione è stata eseguita su LSRFortessa (BD). I dati sono stati analizzati con FlowJo, LLC (BD).

Riduzione dimensionale dei dati di citometria a flusso multiparametrica

Riduzione della dimensionalità condotta con la versione R 4.1.1 utilizzando Bioconductor (versione 3.13) CATALYST (versione 1.16.2). Le analisi sono state eseguite su cellule T CD8+ vive non naïve inclusi i marcatori CD137, CD39, CD38, CXCR3, CD127, CXCR6, PD-1. È stato eseguito il downsampling a 45000 cellule. Le intensità dei marker sono state trasformate da arcsinh (seno iperbolico inverso) con un cofattore di 150. La riduzione della dimensionalità sui dati trasformati è stata ottenuta da t-SNE.

ELISA

Gli anticorpi leganti la punta sono stati valutati mediante Anti-SARS-CoV-2-QuantiVac-ELISA (IgG) (Euroimmun) rilevando S1 IgG (<25,6 BAU/ml: negativo; 25,6-35,1 BAU/ml: marginalmente positivo; ≥35,2 BAU/ ml: positivo) secondo le istruzioni del produttore.

Dichiarazione di disponibilità dei dati

I set di dati generati dalla citometria a flusso e dalla citometria di massa per imaging saranno resi disponibili in conformità con le normative legali su richiesta ragionevole.

Fonti di finanziamento

Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero federale tedesco dell’istruzione e della ricerca (01KI2077 per MH e RT) e della Fondazione tedesca per la ricerca (272983813 per BB, TB, RT, MH e CNH; 256073931 per BB, RT, MH e CNH ; 413517907 a HL, 378189018 a BB). HL e MS sono supportati dal programma IMM-PACT per scienziati clinici, Dipartimento di Medicina II, Centro medico – Università di Friburgo e Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) – 413517907 .TB e SM sono supportati dal programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo. Il lavoro di MH è ulteriormente supportato dalla borsa di studio Margarete von Wrangell (Stato del Baden-Wuerttemberg).

Dichiarazione di conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Contributi degli autori

Ideazione e progettazione dello studio (TB, MH, BB); esperimenti e procedure (BC, HS, HL, LW, ESA, KZ, LK, MS); reclutamento di campioni di pazienti (TB, BB), valutazione istologica (CM,PB), analisi bioinformatica e statistica (BC, HS, HL, ESA); interpretazione dei dati e stesura del manoscritto (TB, MH, BB); revisione del manoscritto per importanti contenuti intellettuali (MP, CNH, RT);

Ringraziamenti

Ringraziamo la paziente per la donazione di campioni e Saskia Killmer e Marilyn Salvat Lago della struttura di citometria di massa di Friburgo per l’eccellente servizio tecnico.

Appendice A. Dati supplementari

I seguenti sono/sono i dati supplementari a questo articolo.

Riferimenti

    • Polacco FP
    • Thomas SJ
    • Kitchin N.
    • Absalon J.
    • Gurtman A.
    • Lockhart S.
    • et al.
    Sicurezza ed efficacia del vaccino BNT162b2 mRNA Covid-19.
    Giornale di medicina del New England. 2020; 383 : 2603-2615
  1. Palla P, Vergadis C, Sakellariou S, Androutsakos T. Lettera all’editore: epatite autoimmune dopo la vaccinazione COVID-19. Un raro effetto negativo? Epatologia;n/a.

    • Bril F.
    • Al Difalha S.
    • Dean M.
    • Fetti DM
    Epatite autoimmune in via di sviluppo dopo il vaccino contro la malattia di coronavirus 2019 (COVID-19): causalità o incidente?.
    Giornale di epatologia. 2021; 75 : 222-224
    • Clayton-Chubb D.
    • Schneider D.
    • Freeman E.
    • Kemp W.
    • Roberts SK
    Commento alla lettera di Bril F et al. “Epatite autoimmune in via di sviluppo dopo il vaccino contro la malattia di coronavirus 2019 (COVID-19): causalità o incidente?”.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Lodato F.
    • Larocca A.
    • D’Errico A.
    • Cennamo V.
    Un caso anomalo di epatite colestatica acuta dopo il vaccino m-RNA BNT162b2 (Comirnaty) SARS-CoV-2: coincidenza, autoimmunità o danno epatico correlato a farmaci?.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Londoño M.-C.
    • Gratacos-Ginès J.
    • Sáez-Peñataro J.
    Un altro caso di epatite autoimmune dopo la vaccinazione SARS-CoV-2. Ancora vittima?.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • McShane C.
    • Kiat C.
    • Rigby J.
    • Crosbie O.
    Il vaccino mRNA COVID-19 – un raro fattore scatenante dell’epatite autoimmune?.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Rocco A.
    • Sgamato C.
    • Rispetto.
    • Nardone G.
    Epatite autoimmune dopo il vaccino SARS-CoV-2: potrebbe non essere una casualità.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Shroff H.
    • Satapatia SK
    • Crawford JM
    • Todd NJ
    • Van Wagner LB
    Danno epatico a seguito della vaccinazione SARS-CoV-2: una serie di casi multicentrici.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Tan CK
    • Wong YJ
    • Wang LM
    • Ang TL
    • Kumar R.
    Epatite autoimmune a seguito di vaccinazione COVID-19: vera causalità o mera associazione?.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Tu GSZ
    • Gleson D.
    • Dube A.
    • Al-Joudeh A.
    Epatite immuno-mediata con il vaccino Moderna, non più una coincidenza ma confermata.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Fernando B.
    Epatite autoimmune in via di sviluppo dopo il vaccino contro la malattia di coronavirus 2019 (COVID-19): una o anche più rondini non fanno estate.
    Giornale di epatologia. 2021;
    • Kabaçam G.
    • Wahlin S.
    • Efe C.
    Epatite autoimmune innescata da COVID-19: una relazione di due casi.
    Internazionale del fegato. 2021; 41 : 2527-2528
    • Alvarez F.
    • Berg PA
    • Bianchi FB
    • Bianchi L.
    • Burroughs AK
    • Canado EL
    • et al.
    Rapporto del gruppo internazionale sull’epatite autoimmune: revisione dei criteri per la diagnosi di epatite autoimmune.
    Giornale di epatologia. 1999; 31 : 929-938
    • Oberhardt V.
    • Luxenburger H.
    • Kemming J.
    • Schulien I.
    • Ciminski K.
    • Giese S.
    • et al.
    Mobilitazione rapida e stabile delle cellule T CD8+ da parte del vaccino mRNA SARS-CoV-2.
    Natura. 2021;
    • Linee guida EASL per la pratica clinica
    Epatite autoimmune.
    Giornale di epatologia. 2015; 63 : 971-1004
    • Younossi ZM
    • Bernstein D.
    • Shiffman ML
    • Kwo P.
    • Kim WR
    • Kowdley KV
    • et al.
    Diagnosi e gestione della colangite biliare primitiva.
    La rivista americana di gastroenterologia. 2019; 114 : 48-63
    • Mehal WZ
    • Juedes AE
    • Croccante IN
    Ritenzione selettiva di cellule T CD8+ attivate da parte del fegato normale.
    J Immunol. 1999; 163 : 3202-3210
    • Belz GT
    • Altman JD
    • PC di Doherty
    Caratteristiche delle cellule T CD8(+) virus-specifiche nel fegato durante le fasi di controllo e risoluzione della polmonite influenzale.
    Proc Natl Acad Sci US A. 1998; 95 : 13812-13817
    • Bowen DG
    • Warren A.
    • Davis T.
    • Hoffmann MW
    • McCaughan GW
    • Fazekas de St Groth B.
    • et al.
    Epatite da spettatore dipendente da citochine dovuta all’attivazione intraepatica dei linfociti T CD8 murini da parte di cellule derivate dal midollo osseo.
    Gastroenterologia. 2002; 123 : 1252-1264
    • Kim J.
    • Chang DY
    • Lee HW
    • Lee H.
    • Kim JH
    • Cantato PS
    • et al.
    La funzione citotossica innata delle cellule T CD8(+) attivate da un astante è associata a lesioni epatiche nell’epatite acuta A.
    Immunità. 2018; 48 ( e165 ) : 161-173
    • Sandalova E.
    • Laccabue D.
    • Boni C.
    • Abbronzatura AT
    • Fink K.
    • Ooi EE
    • et al.
    Contributo delle cellule T CD8 specifiche dell’herpesvirus alla risposta antivirale delle cellule T nell’uomo.
    PLoS Pathog. 2010; 6 e1001051
    • Dudek M.
    • Pfister D.
    • Donakonda S.
    • Filpe P.
    • Schneider A.
    • Laschinger M.
    • et al.
    Le cellule T CD8 CXCR6(+) auto-aggressive causano la patologia immunitaria del fegato nella NASH.
    Natura. 2021; 592 : 444-449
    • Pfister D.
    • Nunez NG
    • Pinyol R.
    • Govaere O.
    • Pinter M.
    • Szydlowska M.
    • et al.
    La NASH limita la sorveglianza antitumorale nell’HCC trattato con immunoterapia.
    Natura. 2021; 592 : 450-456
    • Schwabenland M.
    • Salié H.
    • Tanevski J.
    • Killmer S.
    • Lago MS
    • Schlaak AE
    • et al.
    La profilazione spaziale profonda del cervello umano COVID-19 rivela la neuroinfiammazione con interazioni microanatomiche distinte della microglia-cellule T.
    Immunità. 2021; 54 ( e1511 ) : 1594-1610

Informazioni sull'articolo

Storia della pubblicazione

Fase di pubblicazione

In Press Journal Pre-Proof

Identificazione

DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2022.03.040

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